添加離子對試劑，別忘了這些問題

離子對試劑是一類常用的實驗室試劑，將這類試劑加入到反相色譜流動相中可以增強離子樣品的保留。使用離子對試劑可以改善疏水鍵合相表面的離子交換能力，可以在溫和的流動相pH條件下更好地控制酸性或堿性樣品的保留。

離子對試劑通過試劑上的疏水部分（常見的有庚烷基，十二烷基）與色譜柱固定相發生作用而吸附在柱床上，使固定相具有了一定的離子交換能力，從而增強對帶相反電荷的分析物的保留。

例如常見的辛烷磺酸鈉

離子對試劑是添加在流動相中的，但是其起作用的地方卻是在色譜柱的固定相中。這里以辛烷磺酸鈉為例子。添加在流動相中的離子對試劑隨流動相進入色譜柱，然后離子對試劑會在色譜柱的固定相和流動相之間達到平衡。

根據同性相吸的原理，辛烷磺酸鈉中的8個碳原子的碳鏈會被弱J性的色譜柱的固定相吸附，而大J性的磺酸根離子卻裸露在色譜柱的固定相外面的流動相中。吸附了辛烷磺酸根離子的色譜柱固定相帶上了負電荷，從而能吸附和保留帶正電荷的化合物。

除了提高色譜柱對目標化合物的保留能力，離子對試劑還有一個作用的是改善峰型。

反相色譜柱的固定相的基質主要是硅膠，硅膠表面有大量的羥基。在色譜柱制備過程中嫁接的固定相以及后期的封端工藝會消耗部分羥基，但是仍然有大量的羥基殘留在硅膠基質表面。硅膠基質表面的硅羥基和化合物相互作用會造成拖尾峰。

前面講到離子對試劑對會填充到固定相的縫隙中，這部分離子對試劑能很好的屏蔽硅膠表面殘留的羥基。從而阻止了目標化合物和硅膠表面的羥基相互作用，改善了拖尾峰。

常用的離子對試劑

作用于酸性化合物：
四丁基氫氧化銨， 四丁基氯化銨（四丁基溴化銨），十二烷基*基氯化銨。

作用于堿性化合物：
辛烷磺酸鈉等各種烷基磺酸鹽
三F乙酸，五氟丙酸，七氟丁酸等全氟取代的直鏈有機酸。（全氟取代的直鏈有機酸比較特殊，既是離子對試劑也是調節pH的強酸）。

但是離子對試劑的使用也會不可避免引起一些問題，這里就給各位老師做個介紹。

可能出現的問題和解決方法

色譜柱平衡時間長

相對于不添加離子對試劑的反相色譜方法，離子對色譜法由于涉及到多種復雜的平衡過程，因此一般來說使用離子對試劑的色譜柱平衡時間相對較長。由于離子對試劑的濃度在2-5mmol/L甚至更低的濃度，它們要吸附在反相色譜柱填料的表面，表面濃度在0.5-2μmol/m2。1根4.6×250mm的色譜柱大約有3g填料，需要2mmol的離子對試劑才能*的柱平衡。流動相濃度為2mmol時，需要一升流動相進行平衡。這當然是J端條件，但是用幾百毫升的流動相去平衡色譜柱也是正常的。

由于平衡時間長，當使用離子對試劑時選擇梯度洗脫方法可能會導致一系列的問題，比如保留值重現性較差、基線不穩及其它一些分離問題，因此通常不推薦離子對方法中使用梯度方法。但對于使用小分子離子對試劑如三F乙酸（TFA）和三乙胺（TEA）時，其柱平衡較快，使用梯度洗脫一般也沒問題。

如果需要對色譜柱進行清洗，建議使用50%甲醇-水溶液沖洗維護。

峰形問題
 

通常加入離子對試劑會改善硅膠基質色譜柱上殘留硅醇基團帶來的峰形問題。如果在離子對方法中出現峰形問題，如峰前延等，通過改變溫度可以解決。因此當遇到峰形不好或者理論塔板數下降時，可以研究一下溫度變化對峰形的影響。

空白溶劑峰

在離子對方法中，當進行空白實驗（即注入樣品溶劑）時，正峰和倒峰有時候都會出現，這些異常峰也被稱為空白溶劑峰。這些空白溶劑峰會干擾液相方法的建立或日常應用，因此在離子對方法建立之前和得到有希望的分離之后都應該進行空白實驗。

空白溶劑峰問題通常是由流動相和樣品溶劑之間的差異造成的，使用的緩沖鹽純度不夠、加入了離子對試劑或者其他流動相添加劑都會放大這種影響。

離子對方法開發中的變量影響

離子對方法相比于普通反相方法，可以通過調節參數（包括pH、離子對試劑的類型和濃度、溫度）來滿足分離度等要求。

1. 流動相的pH：在離子對方法中pH不僅影響分析物的離子化程度，也影響加入的離子對試劑的離子化進度而影響與分析物的離子對作用，因此pH的改變對分析物保留的影響更加復雜。

2. 溫度：離子對方法中溫度的改變會引起相對保留值發生顯著性的變化。溫度會改變色譜柱上吸附的離子對試劑的量，因此控制溫度對分離特別重要。

3. 離子對試劑的類型和濃度：大多數情況下，固定相中離子對試劑的濃度會影響溶質的離子交換的保留行為，而離子對試劑的類型和濃度會直接影響其在固定相中的濃度。

當想要獲得一定的保留時，可以使用更低濃度的，疏水性更強的離子對試劑或者更高濃度的，疏水性更弱的離子對試劑。

當固定相中的離子對試劑達到飽和時，繼續增加離子對試劑的濃度反而會降低分析物的保留，因為離子對試劑的反離子濃度增加，加大與分析物的離子交換競爭。

流動相的pH和離子對試劑的濃度的同時改變，則可以在很大程度上控制離子樣品的保留范圍和相對保留值。