離子交換層析的緩沖液和鹽

采用增加離子強度的方法洗脫蛋白質時，通常選用某種非緩沖鹽類，zui常用的是NaCl，添加到起始緩沖液中，構成了洗脫緩沖液。在進行色譜分離時，洗脫緩沖液中的緩沖物質固然會影響到色譜效果，實際上非緩沖鹽的種類和性質同樣會影響到色譜時的分辨率和選擇性，使用不同的非緩沖鹽離子時，可能造成不同物質被洗脫的先后順序發生變化，因此非緩沖鹽的選擇同樣具有重要意義。

在前面離子交換理論部分討論過，價態高的離子與交換劑的結合力更強，所以一般情況下，多價離子是比一價離子更好的置換離子，它們能使蛋白質比較早被洗脫下來 （保留值小）。所以在陽離子交換劑上，蛋白質的保留值與置換離子的關系為：Ba²⁺＜Ca²⁺＜Mg²⁺＜NH₄₊＜K⁺＜Na⁺＜Li⁺，但也存在例外，比如對于溶菌酶來說，NH₄₊是比Mg²⁺更有效的置換離子。在選擇置換離子時，應當考慮到多方面的因素，強的置換離子能有效縮短色譜時間，但往往也降低蛋白質回收率。一般情況下選擇置換能力居中的鹽離子較為合適，在洗脫與交換劑牢固結合的蛋白質時，選用強的置換離子具有優勢。

不但置換離子，洗脫鹽中與功能基團帶同種電荷而不參與離子交換過程的離子也會影響到蛋白質的色譜行為，原因也有多種。有些是因為離子與蛋白質發生作用導致的。此外，二價離子如Ca²⁺和Mg²⁺能與蛋白質分子中的酰胺基形成復合物而影響到其色譜行為。

總之，離子對色譜行為的影響是多方面的，沒有一定的規律。在首ci進行色譜分離時，可優先選擇比較通用的一些緩沖物質和鹽類，在此基礎上再進一步優化。

在有些情況下，在進行離子交換時還會添加一些其他的化合物，其作用主要有：增加蛋白質的溶解度，提高色譜分辨率，保護待分離物質等。大多數蛋白質是溶于水的，但也有部分蛋白質疏水性比較強，在水中的溶解度很小，這使得色譜操作難于實現。具體例子是膜蛋白的分離。膜蛋白存在于生物膜中，其表面是疏水區，與生物膜中疏水性的脂質成分以疏水相互作用結合，這類蛋白在水中是不溶的或溶解度很低。向溶液中添加非離子型或兼性離子型去污劑可以使膜蛋白溶解并分散在水溶液中，便于色譜的進行。有機溶劑（如氯仿、甲醇等）也能增加疏水性蛋白質的溶解度，而且由于有機溶劑降低溶液的介電常數，使得蛋白質與交換劑之間的靜電作用力更強，吸附更為牢固。

某些情況下，添加特定的物質還能提高色譜時的分辨率。例如，在分離一些蛋白質時，添加甜菜堿或牛磺酸能減少蛋白聚集體的形成及其與交換劑的結合，從而提高了分辨率。有的中性聚合物如聚乙二醇（PEG）能與蛋白質競爭溶液中的水分子，這將增加蛋白質與離子交換劑的相互作用而提高分辨率。分離過程中有時還需添加酶抑制劑。例如在蛋白質分離過程中，樣品體系中如果有蛋白酶存在，會造成目的蛋白被水解，使回收率下降，添加蛋白酶抑制劑能夠有效保護目的蛋白。絲氨酸蛋白酶常用的抑制劑是苯甲huang酰氟，巰基蛋白酶常用的抑制劑是碘乙酰胺，金屬蛋白酶可采用金屬螯合劑作為抑制劑。