蛋白純化四大層析原理

基本原理：凝膠層析亦稱凝膠過濾、排阻色譜或分子篩層析等。其機理是分子篩效應，主要根據蛋白質分子的大小進行分離和純化。層析柱中的填料是某些惰性的多孔網狀結構物質，多是交聯的聚糖（如葡聚糖或瓊脂糖）類物質。單個凝膠珠本身象“篩子"。不同類型凝膠的篩孔的大小不同。分子量大的物質不能進入凝膠粒子內部，隨洗脫液從凝膠粒子之間的空隙擠落下來，所以大分子物質遷移速度快；小分子物質要通過凝膠網孔進入凝膠粒子內部，所以小分子物質遷移速度慢。一般來說，凝膠過濾層析柱越細、越長純化的效果越好。

基本原理：據負載電荷的不同分離蛋白質，分辨率高且對樣品的容納能力強。分離原理是基于帶電蛋白質和帶相反電荷的色譜介質之間的可逆相互作用。蛋白質結合到柱子上，然后改變條件，使結合物逐步被洗脫。

這種洗脫通常是通過增加鹽濃度或pH值的變化來進行，采用逐步調整或連續梯度進行洗脫。最常見的，使用鹽（氯化鈉）溶液進行梯度洗脫，通過結合過程濃縮靶蛋白，并且以純化、濃縮的形式收集。

基本原理：根據蛋白質疏水性的差異分離蛋白質。分離的依據是蛋白質與層析介質的疏水表面之間可逆的相互作用。這種作用在高離子強度緩沖液中增強，從而疏水性相互作用層析成為硫酸銨沉淀或離子交換層析過程高鹽溶液洗脫后理想的“下一步"。樣品在高離子強度溶液（如1.5M硫酸銨）中結合到柱子上。然后改變條件，使結合的物質逐漸洗脫下來。

洗脫通常是通過降低鹽濃度。鹽濃度要逐步調整或有一個持續減少的梯度。最常見的是通過硫酸銨鹽濃度遞減的梯度來洗脫樣品。在結合過程中靶蛋白被集中，并以純化和濃縮的形式被收集。其他洗脫程序包括降低洗脫液極性，使用促溶劑（尿素、鹽酸胍）或使用去污劑，改變pH值或溫度。

基本原理：據特異性生物識別，即一種蛋白（或一組蛋白質）和色譜基質上一種特定的配體間可逆的相互作用。這項技術是捕獲或中度純化步驟理想的選擇，只要靶蛋白有合適的配體就可以使用該技術。