疏水作用色譜知多少？別慌，干貨這就來了！

疏水作用色譜（Hydrophobic interaction chromatography HIC）是采用具有適度疏水性的填料作為固定相，以含鹽的水溶液作為流動相，利用溶質分子的疏水性質差異從而與固定相間疏水相互作用的強弱不同實現分離的色譜方法。由于疏水作用色譜的分離原理*不同于離子交換色譜或凝膠過濾色譜等色譜技術，使得該技術與后兩者經常被聯合使用分離復雜的生物樣品。目前該技術的主要應用領域是在蛋白質的純化方面，成為血清蛋白、膜結合蛋白、核蛋白、受體、重組蛋白等，以及一些藥物分子，甚至細胞等分離時的有效手段。

對于小分子物質，根據其極性的大小可以分為親水性分子和疏水性分子，一般來說親水性的小分子是很難與HIC介質發生作用的。但對于疏水作用色譜的主要對象生物大分子如蛋白質而言，其親水性或疏水性是相對的，即使是親水性分子也會有局部疏水的區域，從而可能與HIC介質發生疏水作用，因此能夠根據其疏水性的相對強弱不同進行分離。

HIC介質是在特定的基質如瓊脂糖上連接疏水配基如烷基或芳香基團組成的。HIC介質與具有疏水性的生物分子間的作用被認為與疏水性分子在水溶液體系中的自發聚集一樣，是由熵增和自由能的變化所驅動的。鹽類在疏水作用中起著非常重要的作用，高濃度鹽的存在能與水分子發生強烈作用，導致可以在疏水分子周圍形成空穴的水分子減少，促進了疏水性分子與色譜介質的疏水配基之間發生結合。

因此在HIC過程中，在樣品吸附階段采用高鹽濃度的溶液，使得目標分子結合在色譜柱中，而在洗脫階段，采用降低洗脫劑中鹽濃度的方式使溶質與色譜介質間的疏水作用減弱，從而從色譜柱中解吸而被洗脫下來。對于以芳香基團作為疏水配基的色譜介質來說，還存在潛在的發生π-π作用的可能當待分離物質表面具有芳香基時，就會表現出疏水作用和π-π作用的混合分離模式。

從理論上看，HIC和RPC是兩種密切相關的液相色譜技術，它們都是基于生物分子表面的疏水區域與色譜介質上的疏水配基（烷基或芳香基）之間的流水相互作用，然而在分子水平的色譜機理以及實踐層面上這兩種技術是有所不同的。

RPC介質上疏水配基的取代程度大大高于HIC介質。RPC介質可以認為是連續的疏水相，其配基如C4~C18烷基的取代程度通常在數百微摩/mL凝膠：而HIC介質上配基如C2~C烷基或簡單芳香基的取代程度通常在10~50mmol/mL凝膠范圍內，可以看作是不連續的疏水相，在與生物分子結合時由一個或數個配基參與。

那么很顯然，疏水溶質與RPC介質間的作用力要比HIC介質強得多，需要使用有機溶劑梯度等劇烈的洗脫條件才能將溶質從色譜柱中洗脫下來，對于球狀蛋白質，在這樣劇烈的洗脫條件下往往會發生變性，因此RPC適合在水-有機溶劑體系中具有良好穩定性的肽和小分子蛋白質的分離純化、而HIC過程的洗脫條件要溫和得多，通常降低洗脫劑的鹽濃度就能達到目的，因此HIC既利用了蛋白質的疏水性質，又能夠在更為極性和低變性的環境中進行，因而在蛋白質的純化中有著更為廣泛的應用。

流動相條件對HIC的影響主要表現在所用鹽的種類和濃度、流動相的pH，以及其他添加劑的影響。HIC過程是在高鹽濃度下實現樣品的吸附，而后在低鹽濃度下完成洗脫過程。顯然，流動相中鹽的種類和濃度是HIC中至關重要的參數。不同的離子，特別是陰離子在HIC中的作用是不同的。有些離子存在于溶液中時會促進蛋白質發生沉淀，它們能夠增加疏水作用；而另一些離子的存在卻會促進蛋白質的溶解，稱為促溶鹽類，它們的存在會破壞疏水作用。下表指出了不同離子對疏水作用的影響，表中左邊的離子能夠促進疏水作用，因而經常在HIC中使用，而右邊的離子屬于促溶離子，它們能破壞疏水作用，有時在對色譜介質進行清洗時可以用來洗脫一些結合特別牢固的雜質。

在所用鹽的種類已經確定的情況下，鹽濃度的高低會影響到溶質分子與色譜介質的結合強度及色譜介質的結合容量。鹽濃度的升高能促進疏水作用，因此HIC通常都是在高鹽濃度下加樣并完成吸附，而通過降低洗脫劑中鹽濃度的方法進行洗脫。除此之外，色譜過程的起始鹽濃度的高低還會影響色譜介質對蛋白質的結合容量。

溶液的pH值主要考慮能維持生物大分子生物活性的pH環境。一般情況，溶液的pH接近蛋白質的等電點，其疏水性增加，有利于與固定相配基相互作用；遠離其等電點，其疏水性減少，不利于與固定相配基結合，但有利于蛋白質洗脫。因此通過改變溶液的pH也可以改變蛋白質的疏水性。

不同鹽類對疏水作用的強度有影響，層析中的選擇性也不盡相同；鹽濃度也隨目標分子的疏水性而異，(NH₄)₂SO₄常用0.75~2mol/L，NaCl為1~4mol/L；洗脫方式zui常用降低流動相中鹽濃度的方式洗脫，流動相B為含鹽量較低的緩沖液，緩沖液類型與流動相A一致，B%由0→100。往流動相中添加有機溶劑 ，如：乙二醇、丙醇、異丙醇等，降低流動相極性的方式洗脫 ；往流動相中添加去污劑等 ，去污劑本身能與介質發生強烈吸附，從而將結合在其上的目標組分置換下來。