液相色譜柱的再生方法，升級版本

被常規樣品污染的硅膠基質反相色譜柱，已有各種清洗與再生方法。月旭科技在對普通常規反相柱子的異常沖洗中，一般建議客戶用甲醇-乙腈-異丙醇-乙腈各項沖洗20倍柱體積的方法進行沖洗。

市面上也有些公司推薦使用一些更強溶劑的洗脫方式。如用二氯甲烷：甲醇（96:4，V/V），加1%氫氧化銨沖洗，其中加入的氫氧化銨對聚集在柱頭的污染物具有良好的清洗效果。再如，在用水沖洗色譜柱同時進4等份的200μL二氯甲砜，然后依次用甲醇、氯仿和甲醇沖洗。用N，N-二甲基甲酰胺、丙酮依次沖洗色譜柱。這些方法耗時短，但使用的特殊溶劑，如氫氧化銨、二氯甲砜、N，N-二甲基甲酰胺等，均對色譜固定相有一定的損傷。

2、金屬離子污染色譜柱的清洗

當色譜柱被金屬離子污染后，一般的清洗方法無法生效，需要用特殊的清洗方法。磷酸和0.1mol/L檸檬酸對色譜柱上吸附的金屬離子具有較好的清洗效果，因此常被人們用來清洗被金屬離子污染的色譜柱^[1]乙二胺四乙酸（EDTA）能同許多金屬離子形成配合物，0.05mol/L的EDTA水溶液也可以用來去除色譜柱中金屬離子污染物。

這些試劑雖然能去除金屬污染物，但也存在一些缺陷，如水溶液對固定相的浸潤性較差，清洗效果不太理想；磷酸對固定相上鍵合相有一定的破壞作用；EDTA帶入鈉離子，對固定相性能產生影響。

3、蛋白質污染色譜柱的清洗

蛋白質分子量大，同時具有親水和疏水特性，對很多物理和化學因素敏感。一般情況下，純有機溶劑如乙腈或甲醇不能很好溶解多肽和蛋白質，不能有效地清洗色譜柱，因而需要一些特殊的清洗方法。

現常用方法是用不含緩沖鹽的流動相-0.1%TFA（三氟yi酸）水溶液-乙腈：異丙醇（1:2，V/V，含0.1%TFA）各項沖洗20倍柱體積，或用0.1%TFA（三氟yi酸）：乙腈（1:1，V/V）用0.2mL/min流速，過夜沖洗色譜柱。

當上述方法無效時，可使用一些苛刻的試劑，如鹽酸胍、二甲基甲酰胺及表面活性劑等。如用50%異丙醇水溶液沖洗時，將6mol/L鹽酸胍水溶液與異丙醇按1:1混合，進樣250μL；或者用30%二甲基甲酰胺水溶液清洗，時間不超過30min，處理后反復用水、甲醇沖洗。在常規流動相沖洗色譜柱時，注射500μL的1%十二烷基硫酸鈉（SDS），然后用5%~95%乙腈水（含0.1%TFA）梯度沖洗，去除蛋白污染物效果也較好。^[2]若已確定蛋白質污染種類，可將對應蛋白水解酶（如1%胰蛋白酶或木瓜蛋白酶）注入色譜柱，將蛋白質水解為肽，再用鹽溶液洗脫。

蛋白質污染色譜柱，不論是用高濃度的磷酸鹽溶液，還是用尿素或胍來清洗色譜柱，對色譜柱都會產生較大損傷，同時損害色譜儀器。其中使用注射1%SDS法清洗色譜柱，不僅節省時間，還能得到較好的效果，是現有清洗方法中較優的選擇。

離子交換色譜柱在ji端pH范圍和高鹽濃度條件下長時間使用，或者分析蛋白等生物類樣品后，鹽離子及蛋白質會吸附于固定相表面，導致色譜柱分離能力下降，柱壓升高，峰形變差。

對于污染的離子交換色譜柱，月旭科技的Ultimate^® XB-SCX和Ultimate^® XB-SAX建議用不含有緩沖鹽的流動相-10%甲醇沖洗20倍柱體積。

若常規的方法無法改善色譜柱性能的，可根據色譜柱性質及具體污染情況，選擇強酸性或強堿性溶液、高鹽溶液、含有機溶劑的緩沖溶液、含尿素等溶劑或表面活性劑（非離子型表面活性劑）的緩沖鹽溶液、某些蛋白質變性劑（如鹽酸胍和尿素等）以及蛋白酶中一種或幾種組合進行清洗和再生。

體積排阻色譜是基于分子尺寸大小將物質分離的一種色譜模式。

月旭Xtimate^® SEC的柱子，日常的沖洗建議用10%乙腈或5%乙腈-90%乙腈沖洗20倍柱體積。但當多次使用后，某些樣品可能會吸附到入口篩板或填料上。當積累至一定程度時會出現壓力升高并伴隨峰形展寬的異?，F象，需要進行特殊的沖洗。該沖洗的清洗溶液選擇的基本原則：1）低pH的鹽溶液有助于移除堿性蛋白；2）有機溶劑有助于移除疏水蛋白；3）助溶劑有助于去除在固定相上強吸附的物質（如通過氫鍵作用等）。

注意：只有在中性鹽溶液或有機溶劑沒有明顯改善效果的情況下，使用助溶劑（如：6-8M的尿素或0.2-0.3%十二烷基硫酸鈉）。

參考文獻

[1] 張玉奎，張維冰，鄒漢法. 分析化學手冊[M].第6分冊.液相色譜分析。北京：化學工業出版社，2000.

[2] Ralph A Grohs，F Vincent Warren Jr, Brain A Bidlingmeyrer. Analysis of drugs in the presence of serum albumin by liquid chromatography with eluents containing surfactants [J]. Anal Chem, 1991, 63(4): 384-390.