全面揭秘衍生技術(shù)在液相色譜分析中的應(yīng)用

Hello！小伙伴們大家好，你是否在日常工作中遇到一些化合物難以用常規(guī)的實驗手段分析的情況，這時候我們應(yīng)該怎么辦呢？衍生是一種不錯的選擇方式，今天就跟小編一起來了解下衍生技術(shù)在液相色譜中的應(yīng)用，看看她是如何幫我們克服難題的吧。

化學衍生法是指借助化學反應(yīng)將待測組分接上某種特定基團，從而改善其檢測靈敏度和分離效果的方法利用化學衍生反應(yīng)達到改變化臺物特性的目的，使其更適用于特定分析的過程，在儀器分析中被廣泛應(yīng)用，如色譜（包括氣相 、液相 、超臨界、薄層 、電泳和一些聯(lián)用技術(shù)等）、質(zhì)譜 、核磁 、紫外一可見 、熒光和電化學分析等。

氣相色譜中應(yīng)用化學衍生反應(yīng)是為了增加樣品的揮發(fā)度或提高檢測靈敏度，而高效液相色譜和毛細管電泳的化學衍生法是指在一定條件下利用某種試劑（通稱化學衍生試劑或標記試劑）與樣品組份進行化學反應(yīng)，反應(yīng)的產(chǎn)物有助于色譜檢測或分離。

液相色譜衍生化技術(shù)是色譜分析中常用的輔助手段。衍生技術(shù)可以解決目標物保留性差、不穩(wěn)定、常規(guī)檢測方法不能直接檢測或檢測靈敏度比較低等問題。液相色譜儀的衍生技術(shù)是指將待測物與某種試劑即我們通常稱的衍生試劑反應(yīng)，使之生成易于檢測的化合物的過程。衍生化反應(yīng)從是否形成共價鍵來說，可分為兩種：標記和非標記反應(yīng)。標記反應(yīng)是在反應(yīng)過程中，被分析物與標記試劑之間生成共價鍵。所有其它類型的反應(yīng)，如形成離子對、光解、氧化還原、電化學反應(yīng)等都是非標記反應(yīng)。

另一種區(qū)分衍生化反應(yīng)是從衍生反應(yīng)的場所來分，有柱前衍生化 (pre-column derivatization)，柱上衍生化 (on-column derivatization)和柱后衍生化 (post-column derivatization)三種。

從是否與儀器聯(lián)機的角度來分有：在線 (on-line)、離線(of-line)和旁線 (at—line)(自動化)三種。

使用意大利HT4000A自動樣品處理工作站，可完成復雜的多重自動化衍生操作，如下圖所示，不同品牌液相搭配HT4000A自動樣品處理工作站均可實現(xiàn)離線、在線或旁線衍生。

目前在 HPLC中以離線的柱前衍生法（簡稱柱前衍生法）與在線的柱后衍生法（簡稱柱后衍生法）使用居多。旁線衍生法常用的反應(yīng)有酯化、?；?、烷基化、硅烷化、硼wan化、環(huán)化和離子化和光化學反應(yīng)等。

HT4000A衍生——渦旋混合

接下來我們一起來看看衍生的不同方式

第一種方式將被測物轉(zhuǎn)變成可檢測的衍生物后，再通過色譜柱分離。即將被測物和衍生試劑分別通過兩個或多個輸液泵送到反應(yīng)器里混合，并使之立即反應(yīng)完成，隨之進入色譜柱，這就是在線柱前衍生了；

也可以先將被測物和衍生試劑反應(yīng)，再將衍生物作為樣品進樣，進行色譜分析，此時該方法為離線柱前衍生；有的文獻中提到也可以在流動相中加入衍生試劑，進樣后，讓被測物與流動相直接發(fā)生衍生反應(yīng)這樣就是在線衍生。

柱后衍生是指先將被測物分離，再將從色譜柱流出的溶液與衍生試劑在線混合，生成可檢測的衍生物，然后導入檢測器。按生成衍生物的類型可分為紫外可見光衍生、熒光衍生、拉曼衍生和電化學衍生和光化學衍生等。

氨基酸柱后/柱前衍生示意圖

1、紫外可見光衍生：

1）紫外衍生是指將紫外吸收弱或無紫外吸收的有機化合物與帶有紫外吸收基團的衍生試劑反應(yīng)，使之生成可以用紫外檢測的化合物。如胺類化合物容易與鹵代烴、羰基、?；愌苌噭┓磻?yīng)。

2）可見光衍生有兩個主要的應(yīng)用：一是用于過渡金屬離子的檢測，將過渡金屬離子與顯色劑反應(yīng)，生成有色的配合物、螯合物或離子締合物后用可見光檢測；二是用于有機離子的檢測，在流動相中加入被測離子的反離子，使之形成有色的離子對化合物后，分離檢測。

2、熒光衍生：

熒光衍生是指將被測物與熒光衍生試劑反應(yīng)后生成具有熒光的物質(zhì)進行檢測。有的熒光衍生試劑本身沒有熒光，而其衍生物卻有很強的熒光。衍生技術(shù)不僅使液相色譜儀分析體系復雜化，而且需要消耗時間，增加分析成本，有的衍生反應(yīng)還需要控制嚴格的反應(yīng)條件。因此，只有在找不到方便而靈敏的檢測方法或為了提高分離檢測的選擇性時，才考慮用衍生技術(shù)。

3、光化學衍生：

光化學衍生（PhotoChemical Derivatization, PCD）分析法是基于光化學反應(yīng)而建立的一類分析方法，它以其du特的衍生方式與傳統(tǒng)的熒光，化學發(fā)光，紫外-可見，電化學等檢測方法相結(jié)合，提高了原有方法的靈敏度與選擇性，極大地拓展了傳統(tǒng)檢測方法的應(yīng)用范圍，在藥物、復雜生物樣品，環(huán)境樣品分析測定等方面得到廣泛應(yīng)用。

柱后化學衍生反應(yīng)主要以熒光分析為主，也有以電化學檢測的分析方法。光化學反應(yīng)的主要類別如下：分子內(nèi)能量轉(zhuǎn)移、碰撞能量轉(zhuǎn)移、淬滅、光致離子化、異構(gòu)化、直接反應(yīng)、分子間分解。

WelView光化學衍生器

AFT經(jīng)柱后光化學衍生后，能發(fā)射特征性熒光，被熒光檢測器捕獲后而得到檢測，最后經(jīng)色譜工作站處理數(shù)據(jù)。 光化學衍生搭配FLD檢測器可以有效的檢測低濃度的黃曲霉毒素，方法靈敏度遠高于其他檢測方法。

光化學衍生器與HPLC聯(lián)用示意圖

色譜柱：月旭氨基酸分析柱 Amino Acid，5μm，4.6×250mm。