蛋白結合的解離常數以及在蛋白檢測和親和分離中的應用

蛋白和配體結合的強弱不同，對于蛋白檢測以及親和分離純化實驗有顯著影響。在設計實驗時應考慮這種結合強弱影響，以便采用合適的蛋白或配體濃度（包括zui低檢測限濃度），估算結合時間，獲得最佳并且實用的結果。 這對于室溫下易失去活性，或希望盡可能保持最高活性蛋白的純化尤為重要。

常規的蛋白檢測方法，比如ELISA，只能測定實驗結束時的蛋白結合數值，不能跟蹤整個過程。這不利于獲取結合的動力學數據，阻礙了實驗的優化。自從上個世紀90年代Biacore商品化surface plasmon resonance技術后，目前已有幾種生物傳感器技術，能夠跟蹤蛋白和配基的real-time結合過程，檢測結合的全部過程，給出結合的動力學數據。下圖是我在SRU Biosystems用光學生物傳感測定蛋白A和不同濃度人類IgG隨時間變化的結合曲線。IgG濃度在100μg/mL時，結合在2-3分鐘內迅速上升后，緩慢增加。在濃度減小時，結合速度變慢。濃度在6.25μg/mL時，結合在180分鐘內持續穩定地增加。濃度小于1μg/mL時，結合仍然進行，但是十分緩慢。

絕大多數生化實驗室，沒有real-time跟蹤檢測手段，蛋白檢測或者純化過程中，確定蛋白的濃度和結合時間通常根據結合的強弱來確定，而結合強弱是通過解離常數來判斷的。

在化學、生物化學中，解離常數（K_D) 是一種反應的平衡常數，用于測量較大物體可逆地分離（解離）成較小成分的傾向。解離常數是結合常數的倒數。 雖然解離常數是動力學理論的參數， 但是它在生物化學，尤其實驗設計上有現實意義的指導作用。

鏈霉親和素（streptavidin）是生物化學常用的試劑。它于生物素（biotin）結合的K_D非常小，僅為~10^?14M。 強度與共價鍵類似。前文介紹過，鏈霉親和素是非常穩定50K_D蛋白，經常用來與熒光、紅外、ELISA標記等化學結合而不失去其生物活性。生物素是分子量244，帶有羧基的小分子。 容易與蛋白化學結合。這樣帶有標記的鏈霉親和素，與帶有生物素的蛋白結合，從而避免直接標記蛋白。鏈霉親和素和生物素K_D小。對比于直接標記二抗的方法，采用標記的鏈霉親和素-生物素的方法用量小、時間短，達到準確檢測的目的。基于這種原因，標記的鏈霉親和素、化學活化的生物素以及生物素結合的二抗等蛋白檢測試劑，比較容易購買，這對于實驗方案設計非常便利。